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吉林大学:利用CRISPR/Cas9构建转基因猪
  
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吉林大学的研究人员报告说,他们已经利用CRISPR/Cas9系统高效构建了肌生长抑制素(MSTN)基因突变猪。研究结果发表在11月13日的《《ScientificReports》》杂志上。本文作者是吉林大学的大辛方教授和壶瓶角教授。

定制核酸内切酶技术的发展可以促进转基因动物的构建,并利用它们探索基因功能和产生人类遗传病模型。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9可以在特定位点引入脱氧核糖核酸双链断裂,然后通过非同源端到端连接(NHEJ)或同源重组进行修复。一般来说,NHEJ修复过程会导致双链断裂区基因突变的轻微缺失或插入。CRISPR/Cas9由于其高效率和快速组装能力,已成为三种内切核酸酶技术中更强大的工具。目前,研究人员利用CRISPR/Cas9系统成功构建了许多转基因动物,如斑马鱼、果蝇、小鼠和猴子(extended reading:Nature:breakthrough CRISPR technology),以生成“安全”的转基因作物。

肌生长抑制素(MSTN),作为TGF-β超家族的一员,在肌肉生长中起着负调节作用,这为提高家畜的生长性能带来了很大的希望。与野生型小鼠相比,MSTN敲除(KO)小鼠表现出更强的肌肉群,一些具有天然MSTN突变的牛品种也表现出更强的肌肉群。先前的研究表明,在进化过程中,猪MSTN基因和牛和羊MSTN经历不同的选择压力。MSTN有可能在猪身上有不同的表达方式或扮演不同的角色。猪是世界上最重要的家畜之一,中国的猪肉消费量尤其大。因此,构建MSTN基因敲除猪对肌肉发育和产肉性能的影响具有重要意义。

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先前的研究报告称,靶向猪的基因是通过向受精卵中注射Cas9mRNA和sgRNA细胞质或使用抗生素选择的成纤维细胞进行体细胞核移植而产生的(SCNT)。然而,这两种方法都有缺点。将Cas9mRNA和sgRNA共注射到受精卵中会产生具有不同表型的嵌合动物,完成猪的进一步繁殖需要时间和成本。来自药物选择成纤维细胞的基因工程猪通常携带抗生素抗性基因,并且它们越来越受到生物安全性的关注。

在这篇新文章中,吉林大学的研究人员报告说,他们将猪胚胎成纤维细胞的转染效率提高了近90%,从而提高了靶向载体的突变效率。他们还证实CRISPR/Cas9系统可以诱导猪胚胎成纤维细胞MSTN位点的NHEJ、长片段缺失/倒置和同源定向修复(HDR)。

最后,研究人员利用Cas9/gRNA修饰的无选择性标记基因的成纤维细胞,通过体细胞核移植产生基因靶向猪,并获得8只MSTN双等位基因突变的克隆仔猪。部分仔猪表现出明显的肌间沟和大舌头沟,这是二头肌的表型特征。与对照组相比,突变克隆猪的MSTN蛋白水平下降。他们还分析了MSTN的基因水平和相关的信号通路因素。最后,研究人员仔细评估了克隆猪的缺失突变。

作者说新研究中使用的基因编辑平台可以有效地产生生物安全转基因猪。

生物交流建议摘要:

使用crispr/Cas9系统在猪体内高效产生肌生长抑制素突变

转基因猪越来越多地用于生物医学和农业应用。高效的CRISPR/Cas9基因编辑系统对于产生无选择标记基因的基因打靶猪有很大的希望。在这项研究中,我们旨在破坏猪肌生长抑制素(MSTN)基因……

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